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蛋白质的离心过滤
时间:2020-01-16 10:21:41   来源:www.hzshenlong.com   点击:
如何使用离心过滤器
当开始大量浓缩时,让它先旋转5分钟,以确定溶液流过过滤器的速度,然后用它来决定旋转所需的时间。zui好先旋转不超过15分钟,然后用移液管轻轻混合样品2-3次,以避免堵塞膜,从而避免在此阶段损失您的辛勤工作和金钱。当混合时,你会看到靠近膜的粘性更大的蛋白质溶液漩涡上升并扩散到浓度较低的溶液中。移液时,特别注意不要用移液器尖端接触和破坏膜,并且只能从过滤器边缘移液。

离心过滤器故障排除
蛋白质沉淀
人们在使用离心过滤器时面临的一个常见问题是蛋白质沉淀的问题。这主要是因为浓缩时蛋白质梯度的形成和膜附近的局部高浓度。如上所述,可以通过定期混合溶液来避免这种情况。

另外,确保缓冲液的酸碱度不要太接近你感兴趣的蛋白质的等电点。

最后,确保缓冲液中的DTT是新制成的。DTT在pH 8.0时不稳定,随着时间的推移可能失活。因此,二硫键的形成可能以随机和非自然的方式开始,并因此形成不同的蛋白质二硫化物低聚物,其可能是不溶的。


蛋白质与离心过滤膜的结合
这一特性很大程度上取决于过滤器膜的组成,无论是聚砜、聚酯砜还是再生纤维素。就我个人而言,避免再生纤维素,因为我发现蛋白质与膜的结合是这些过滤器更大的问题。许多人添加0.1%(体积比)吐温20或Triton X-100来缓解这个问题。为了提高样品的浓缩速度,同时使用几个离心过滤器是很有诱惑力的,但这不是一个好主意,因为这可能会由于蛋白质与膜结合的潜在问题而增加损失。

zui后,浓缩蛋白质后,检查浓度通过获取280纳米处的吸光度或使用布拉德福测定法,以方便和可用的为准。
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